Ligation Independent Cloning (LIC)

کلونینگ مستقل از Ligation (LIC) به فعالیت اگزونوکلئاز 3-5 T4 DNA پلیمراز متکی است.
اگزونوکلئاز آنزیمی است که نوکلئوتیدها را از انتهای رشته DNA خارج می‌کند. در LIC، فعالیت اگزونوکلئاز T4 DNA پلیمراز باعث ایجاد انتهای‌ جویده شده از 10-12 جفت باز در انتهای 5 هر دو قطعه وکتور و درج می‌شود. این انتهاها به راحتی می‌توانند محصولی دایره‌ای با چهار nick ایجاد کنند و توسط باکتری‌ها ترمیم شوند. LIC نیازی به ترکیب مجدد مخصوص سایت یا مرحله بستن ندارد، و این یک روش کلونینگ آسان، ارزان و سریع است.
بنابراین این روش دقیقاً چگونه کار می کند؟
LIC به افزودن فقط یک dNTP آزاد به واکنش بستگی دارد.
در حضور یک dNTP منفرد آزاد، T4 پلیمراز به عنوان اگزونوکلئاز به کار خود ادامه خواهد داد تا زمانی که باز در یک انتهای تک رشته قرار گیرد و مکمل نوکلئوتید آزاد باشد. با توجه به این، T4 پلیمراز در این مرحله گیر می کند.
انتهاهای مکمل بر اساس توالی وکتور مقصد و انتخاب محل محدودیت، در پرایمرهای PCR برای درج تعبیه شده است. این محصول ممکن است مستقیماً به E. coli وارد می‌شود، جایی که نیک‌ها با فرآیند تکثیر طبیعی ترمیم می‌شوند.